Investigadores han desarrollado una nueva técnica de imagen mejorada de ADN que puede analizar la estructura de cadenas de ADN individuales a nivel de nanoescala. Dado que el ADN está en la raíz de muchos procesos de enfermedad, la técnica podría ayudar a los científicos a obtener información importante sobre qué funciona mal cuando se daña el ADN o cuando otros procesos celulares alteran la expresión génica.
El nuevo método de formación de imágenes se basa en una técnica llamada microscopía de una sola molécula mediante la adición de información sobre la orientación y el movimiento de colorantes fluorescentes unidos a la cadena de ADN.
El doctor W. E. Moerner, de la Universidad de Stanford, en Estados Unidos, es el fundador de la espectroscopia de una sola molécula, un método sin precedentes de 1989 que permitió a los científicos visualizar moléculas individuales con microscopía óptica por primera vez. Galardonados con el Premio Nobel en 2014 por la microscopía óptica más allá del límite de difracción (Moerner, Hell & Betzig) , Moerner y Betzig utilizaron moléculas individuales para tomar la imagen de una densa matriz de moléculas en diferentes momentos.
En la revista de la Sociedad Óptica para la Investigación de Alto Impacto, Optica, el equipo de científicos dirigido por Moerner describe su nueva técnica y la demuestra mediante la obtención de imágenes de super-resolución y mediciones de la orientación de miles de moléculas con colorante fluorescente individuales unidas a las cadenas de ADN.
'Se puede pensar en estas nuevas mediciones como proporcionar pequeñas flechas de doble cabeza que muestran la orientación de las moléculas unidas a lo largo de la cadena de ADN -pone como ejemplo Moerner--. Esta información de la orientación aporta datos sobre la estructura local de las bases de ADN porque limita la molécula. Si no tuviéramos esta información de la orientación, la imagen no sería más que un punto'.
Una hebra de ADN es una cadena muy larga, pero estrecha, de sólo unos pocos nanómetros de diámetro. Se puede utilizar la microscopía de una sola molécula, junto con colorantes fluorescentes que se unen al ADN, para visualizar mejor esta pequeña cadena. Hasta ahora, era difícil entender cómo se orientan estos tintes y era imposible saber si el colorante fluorescente se une al ADN de una manera rígida o algo floja.
Adam S. Backer, primer autor del artículo, desarrolló una forma bastante sencilla de obtener la orientación y la dinámica de rotación entre miles de moléculas individuales en paralelo. 'Nuestra nueva técnica de imagen examina cómo cada molécula de colorante individual que etiqueta el ADN se alinea respecto a la estructura mucho mayor del ADN', dice Backer.
'También estamos midiendo cómo de tambaleantes son cada una de estas moléculas, lo que nos puede decir si esta molécula se ha quedado atascada en una alineación particular o si fracasa en torno a lo largo de nuestra secuencia de medición', añade.
La nueva técnica ofrece información más detallada que los llamados métodos 'conjunto' de hoy en día, que promedian las orientaciones de un grupo de moléculas, y es mucho más rápido que las técnicas de microscopía confocal, que analizan una molécula a la vez. El nuevo método se puede emplear incluso para moléculas que son relativamente tenues.
Debido a que la técnica proporciona información a nanoescala sobre el propio ADN, podría ser útil para seguir los cambios de conformación de ADN o el daño a una región particular del ADN, que podría mostrar cómo cambia la orientación de las moléculas coloreadas. También podría ser empleada para monitorear las interacciones entre el ADN y las proteínas, que conducen a muchos procesos celulares.
30.000 orientaciones de una sola molécula
Los investigadores probaron la técnica de imagen mejorada mediante el uso de ADN para analizar un colorante intercalante; un tipo de colorante fluorescente que se desliza en las áreas entre las bases de ADN. En un experimento típico de formación de imágenes, adquirieron hasta 300.000 ubicaciones de una sola molécula y 30.000 mediciones de la orientación de una sola molécula en poco más de 13 minutos.
El análisis mostró que las moléculas con colorante individuales se orientan perpendiculares al eje de la cadena de ADN y que mientras que las moléculas tienden a orientarse en esa dirección perpendicular, también se movían alrededor dentro de un cono restringido.
Entonces, los autores realizaron un análisis similar utilizando un tipo diferente de colorante fluorescente que consta de dos partes: una parte que se conecta al lado del DNA y una parte fluorescente que se une a través de una correa flexible. La técnica de imagen mejorada de ADN detectó flacidez, lo que demuestra que el método podría ser útil para ayudar a los científicos a entender, molécula a molécula, si las diferentes etiquetas se unen al ADN de una manera móvil o fija.
En el documento, los investigadores demostraron una resolución espacial de unos 25 nanómetros y mediciones de la orientación de una sola molécula con una precisión de alrededor de 5 grados. También midieron la dinámica de rotación, o flacidez, de moléculas con una precisión de unos 20 grados.
Para adquirir información de la orientación de una sola molécula, los autores utilizaron una técnica bien estudiada que añade un elemento óptico llamado modulador electro-óptico al microscopio de una sola molécula. Para cada marco de la cámara, este dispositivo cambia la polarización de la luz láser que se utiliza para iluminar todos los colorantes fluorescentes.
Dado que las moléculas de colorantes fluorescentes con orientaciones más estrechamente alineadas con la polarización de la luz láser aparecerán más brillantes, medir el brillo de cada molécula en cada marco de la cámara permitió a los investigadores cuantificar la orientación y la dinámica rotacional sobre una base molécula por molécula.
Las moléculas que se cambiaron en fotogramas secuenciales entre claro y oscuro se vieron limitadas rígidamente en una orientación particular, mientras que las que aparecieron brillantes a lo largo de los fotogramas secuenciales no estaban manteniendo rígidamente su orientación.
'Si alguien tiene un microscopio de una sola molécula puede realizar nuestra técnica con bastante facilidad mediante la adición del modulador electro-óptico', señala Backer. 'Hemos utilizado herramientas bastante estándar de una manera ligeramente diferente y analizamos los datos de una nueva forma para ganar biológica adicional y penetración física', concluye.